S3 - Doktor

Permanent URI for this community

https://repository.unpad.ac.id/handle/kandaga/178

Browse

Browsing S3 - Doktor by Author "IRMA ERIKA HERAWATI"

Now showing 1 - 1 of 1
  • No Thumbnail Available
    Item
    MEKANISME SITOTOKSISITAS PROTEIN RICIN DARI BIJI JARAK (Ricinus communis L.) TERHADAP SEL KANKER PARU-PARU A549 SECARA IN SILICO DAN IN VITRO
    (2022-10-17) IRMA ERIKA HERAWATI; Anas Subarnas; Ronny
    Kanker paru-paru merupakan salah satu penyebab utama kematian di dunia. Terapi kanker dapat dilakukan dengan menghambat atau membunuh sel kanker dan perkembangannya melalui apoptosis (program kematian sel) yang dapat diamati secara in vitro. Obat antikanker yang sekarang banyak digunakan secara klinis terbukti memiliki sifat sitotoksik dan dapat menyebabkan kematian secara apoptosis. Saat ini tidak sedikit hasil penelitian yang menunjukkan bahwa bahan alam dan metabolit sekundernya memiliki aktivitas antikanker yang dapat menghambat proliferasi dan menginduksi apoptosis pada berbagai jenis sel kanker. Salah satu tanaman toksik yang memiliki potensi antikanker dan masih membutuhkan eksplorasi lebih lanjut terhadap sel kanker paru-paru adalah tanaman jarak (Ricinus communis L.) yang termasuk ke dalam keluarga Euphorbiaceae. Jarak merupakan tanaman tropis yang banyak ditanam di Jawa Timur, Indonesia. Daun dan biji tanaman ini telah digunakan secara tradisional untuk menyembuhkan penyakit hati, gangguan lambung, peradangan, demam, sakit kepala, dll. Ricin, zat beracun yang diisolasi dari biji jarak, adalah protein polipeptida heterodimer yang mencakup rantai A (30 kDa) dan rantai B (35 kDa) dihubungkan oleh ikatan disulfida. Menariknya, beberapa penelitian mengungkapkan bahwa ricin memiliki sifat sitotoksisitas terhadap berbagai sel kanker. Dalam penelitian ini, protein ricin yang diekstraksi dari biji jarak diidentifikasi dengan menggunakan (1) liquid chromatography (LC); (2) column liquid chromatography (CLC); dan (3) fast protein liquid chromatography (FPLC), diikuti oleh sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Crude ricin (CR) diteliti untuk diketahui sitotoksisitasnya pada sel kanker paru-paru A549 dengan uji Presto Blue, dieksplorasi pengaruhnya pada proses apoptosis menggunakan flow cytometry dan Western blot, kemudian kemampuan migrasi selnya diukur dan dieksplorasi pengaruhnya dalam proses autofagi dengan Western blot. Selain itu, dilakukan juga studi in silico untuk menelaah ikatan yang terjadi antara ricin rantai A terhadap protein-protein yang berperan pada tahap apoptosis (caspase-3, -8, dan -9) dan protein-protein yang berperan pada setiap tahap proses autofagi (Beclin-1, ATG5, LC3 atau Light Chain 3, dan p62/Sequistrosome1). Struktur kristal sinar-X dari caspase-3, -8, -9, Beclin-1, ATG5, LC3, dan p62 diunduh dari https://www.rcsb.org/structure/. Docking protein-protein dilakukan dengan menggunakan server online ClusPro (https://cluspro.org/). Identifikasi CR menunjukkan bahwa semua teknik kromatografi yang digunakan secara positif mengkonfirmasi keberadaan protein ricin. Adanya protein ricin ditunjukkan dengan puncak doblet ricin rantai A dan rantai B pada semua kromatogram. Hasil elektroferogram SDS-PAGE membuktikan bahwa protein ricin dapat teridentifikasi pada BM 35 kDa. Dari hasil elektroferogram, metode CLC ternyata dapat memisahkan dua protein pada BM 33 kDa (ricin rantai A) dan 36 kDa (ricin rantai B), sementara metode FPLC hanya dapat mengekspresikan satu protein 35 kDa. Hasil studi in silico menyatakan bahwa ricin rantai A memiliki mode pengikatan yang serupa dengan Ac-DEVD-AFC (substrat caspase-3) yaitu ikatan hidrogen (Ser205, Arg207, Ser209) dan interaksi hidrofobik (Trp206 dan Phe256). Ricin rantai A berinteraksi dengan Arg413 dan Ser411 yang terletak antiparalel di kantong pengikat caspase-8. Sebagian ricin rantai A juga berikatan dengan Val410, residu yang terletak di kantung S2 caspase-8. Selain itu, ricin rantai A berinteraksi dengan beberapa residu asam amino di caspase-9. Sementara hasil docking ricin rantai A dengan protein-protein autofagi, menunjukkan bahwa ricin rantai A dapat berinteraksi dengan Beclin-1, ATG5, LC3, dan p62 melalui pembentukan ikatan hidrogen pada residu-residu asam amino. Hasil pengujian secara in vitro membuktikan bahwa CR memiliki sitotoksisitas terhadap sel kanker paru-paru A549 dengan nilai IC50 40,94 ppm, lebih tinggi dibandingkan cisplatin yang memiliki IC50 10,98 ppm. Hal ini mengindikasikan bahwa sitoksisitas CR terhadap sel kanker paru-paru A549 lebih rendah dari pada cisplatin. Analisis flow cytometry mengidentifikasikan bahwa kematian sel oleh CR disebabkan oleh apoptosis serta nekrosis, tetapi apoptosis terjadi lebih sering daripada nekrosis, yang menunjukkan bahwa CR lebih kuat dalam menginduksi apoptosis daripada nekrosis. Terjadinya apoptosis kemungkinan lebih cepat karena sebagian besar sel mengalami apoptosis pada fase awal. Pengujian apoptosis dengan metode Western blot memperlihatkan bahwa CR dapat menginduksi apoptosis melalui aktivasi caspase-9 dan caspase-3, yang ditandai oleh peningkatan ekspresi kedua protein apoptosis tersebut. Pada pengujian migrasi sel, CR dan cisplatin menghambat migrasi sel secara signifikan yang bergantung pada konsentrasi dan waktu, dan efek tertingginya diberikan oleh konsentrasi 1,0 ppm dengan penutupan celah masing-masing 3,10 dan 3,28% dalam inkubasi 48 jam. Pengujian aktivitas autofagi mengindikasikan bahwa CR dapat menurunkan kadar Beclin-1 dan meningkatkan kadar ATG5, serta menurunkan kadar LC3-II dan meningkatkan kadar p62. Beclin-1 merupakan komponen penting untuk langkah nukleasi fagofor autofagi, sedangkan ATG5 adalah protein yang sangat diperlukan untuk membentuk autofagosom. LC3-II dikenal sebagai satu-satunya biomarker protein yang secara andal terkait dengan pembentukan autofagosom dan pematangan, dan p62 adalah protein pengikat yang berfungsi sebagai penghubung antara LC3 dan substrat autofagi. Hal ini membuktikan bahwa CR dapat menghambat autofagi pada tahap awal di sel kanker paru-paru A549. Penghambatan autofagi juga ditunjukkan oleh cisplatin karena efeknya pada protein penanda autofagi sama dengan CR. Berdasarkan hasil keseluruhan dari penelitian ini, CR memiliki potensi sebagai kandidat obat antikanker, tetapi penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengungkapkan profil aktivitas antikanker yang lebih lengkap.